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探针合成的注意事项
①合成探针的长短,一般在20~50个核苷酸之间。合成过长成本高,且易出现聚合酶合成错误,杂交时间长,合成太短则特异性下降。②碱基组成G-C应含40%~60%,一种碱基连续重复不超过4个,以免非特异性杂交产生。③探针自身序列内应无互补区域,以免产生“发夹”结构,影响杂交。总之,一个好的探针终要在实践中才能加以确认。
探针是一小段单链DNA或者RNA片段(大约是20到500bp),用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链,随后用放射性同位素(通常用磷-32)、荧光染料或者酶(如辣根过氧化物酶)标记成为探针。磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中,而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。
当将探针与样品杂交时,探针和与其互补的核酸(DNA或RNA)序列通过氢键紧密相连,随后,未被杂交的多余探针被洗去。后,根据探针的标记物种类,可进行放射自显影、荧光发光、酶联化学发光等方法来判断样品中是否,或者何位置含有被测序列(即与探针互补的序列)。
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