DNA探针的杂交方法

    对任何DNA探针测定来说，杂交反应包括四个基本要素：探针、靶物质（样品中的待测核酸）、检验方法（根据采用的标记物或报告基因而定）和杂交模式。核酸分子杂交可分为液相杂交和固相杂交。

1．液相杂交

    液相杂交是让DNA探针和待测核酸在溶液中进行反应。在溶液中，待测核酸和探针均自由运动，增加了两者结合的机会，因此液相杂交要比固相杂交快5～10倍。但液相杂交不易分离杂交体和游离核酸探针，常规应用不易。

2．固相杂交

    固相杂交是先将待测核酸样本结合到固相载体上，再与溶于溶液中的检测杂交信号后分析杂交结果。

    固相杂交的基本程序是：①准备待测样本；②制备和标记探针；③固相载体的处理；④预杂交、杂交、漂洗；⑤杂交信号检测；⑥结果判断及分析。

    常用的固相杂交方法有斑点杂交法、夹心杂交法和原位杂交法等。下面简单介绍几种常用的核酸分子固相杂交方法。

    ①斑点杂交法（dot blot hybridization）：常用的杂交模式．将样品DNA直接点在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，在严格的条件下杂交后进行检测。斑点杂交法简单、迅速，不需要限制性核酸内切酶消化DNA，也不需要凝胶电泳和转移，且在一张膜上可检测多个样品。该方法敏感性高，但对杂交条件控制不严可出现非特异性杂交。

    ②夹心杂交法（sandwich hybridization）：采用位于待测基因两个相邻但不重叠的DNA序列制作探针，先将**个不标记的探针（A探针，捕捉探针）吸附于固相支持物（如膜、孔或管）上，捕捉待测样本中与其互补的目标序列，然后加入**个标记的探针（B探针，检测探针），与其互补序列结合后即可检测杂交信号。夹心杂交法的优点是特异性好，而且对核酸样品的纯度要求不高。